Keď sa oživené exponáty v Americkom prírodovednom múzeu v New Yorku začnú správať čudne, Larry, čerstvo povýšený riaditeľ nočnej prevádzky múzea, musí zistiť, čo sa stalo. Magická zlatá doska, vďaka ktorej exponáty každú noc ožívajú, začína pomaly korodovať a kúzlo sa pomaly ale neúprosne vytráca. Odpoveď na to, ako ho obnoviť, sa skrýva v Britskom múzeu v Londýne. Larry by pre záchranu svojej múzejnej rodiny urobil čokoľvek, a tak sa vydá spolu so svojím synom Nickom a všetkými živými exponátmi na cestu z New Yorku do Londýna, aby tu tajomstvo zlatej dosky rozlúštili. Pripravte sa tretiu, najdivokejšiu a najdobrodružnejšiu Noc v múzeu. Jej hlavným hrdinom je opäť najznámejší nočný strážca na svete Larry (Ben Stiller), ktorý pracuje v Americkom prírodovednom múzeu v New Yorku, v súčasnosti povýšený na riaditeľa nočnej prevádzky. A práve tu, na jeho pracovisku, každú noc ožívajú muzeálne exponáty! Za týmto neuveriteľným kúzlom stojí mystická zlatá doska pochádzajúca zo starovekého Egypta, ktorá je zároveň najvzácnejším exponátom múzea. O jej kúzle a oživených exponátoch okrem Larryho nevie nik. Larry sa počas nočných služieb rozhodne nenudí a navyše má medzi múzejnými kúskami rad priateľov alebo aspoň známych. Patrí medzi nich faraón Ahkmenrah (Rami Malek), prezident Theodore Roosevelt (Robin Williams), najmocnejší vládca Hunskej ríše Attila (Patrick Gallagher), rímsky vojak Octavius (Steve Coogan), partia neandertálcov, kovboj Jedediah (Owen Wilson) a mnoho ďalších. Občas si pre poškrabkanie príde aj kostra Tyranosaura. Živých aj neživých hrdinov však čaká nemilé prekvapenie. Zlatá doska začína napriek svojmu materiálu korodovať a kúzlo sa pomaly ale neúprosne vytráca. Pre oživené exponáty a ich ochrancu Larryho je to otázka života a smrti. Čakajú ich nielen krušné chvíľky, ale aj najväčšie životné dobrodružstvo, ktoré ich privedie až za Atlantik. Rozlúštenie záhady a riešenie ich problému sa totiž nachádza ukryté v oddelení egyptských zbierok Britského múzea v Londýne. V tejto slávnej a významnej inštitúcii sa k nim pridajú nielen tunajší oživení múzejní hrdinovia na čele s rytierom Lancelotom (Dan Stevens), ale aj miestna nočná strážnička Tilly (Rebel Wilson). V metropole Británie však Američanov nečakajú len nové priateľstvá. Aby zachránili kúzlo a tým aj seba, musia čeliť mnohým nebezpečenstvám a poraziť silného protivníka.